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维生素B2检测试剂盒(荧光光度法)用于定量检测血清、血浆、组织等样品中的维生素B2(核黄素)含量。

利用Vitamin B2的中性溶液有强荧光，当加入有还原性的亚硫酸盐时，核黄素被还原为无荧光的物质，根据稀核黄素溶液在还原前后荧光强度的变化即可定量检测Vitamin B2的含量，其激发波长为440～500nm(多为460nm)，发射波长为510～550nm(多为520nm)。

组分	规格	保存
Vitamin B2标准(100μg/mL)	1.5mL	4℃避光
10×组织匀浆液	250mL	RT
亚硫酸盐	4×100mg

保存：2～8℃，避光，有效期6个月。

• 待测样品如青菜、水果、牛奶、药品、蒸馏水、稀盐酸或氢氧化钠(0.1mol/L)等。
  
• 精密天平、匀浆器、pH计或pH试纸、离心机、离心管、锥形瓶、容量瓶、高压灭菌锅或恒温水浴锅、荧光分光光度计。

• Vitamin B2见光易分解，在上述操作中，应严格避免阳光直射。
  
• 组织匀浆液为酸性，有腐蚀性，应小心操作。
  
• 待测样品如不能及时测定，应置于2～8℃避光保存，3天内稳定。
  
• Vitamin B2在碱性溶液中不稳定，因此在加稀氢氧化钠调pH值时应边加边摇，防止局部碱度过大，破坏Vitamin B2。
  
• 样品提取液中如有色素，会吸收部分荧光，需要使用高锰酸钾氧化除去色素。
  
• Vitamin B2不易被中等氧化剂或还原剂破坏，但有Fe²⁺存在时，可被过氧化氢破坏。
  
• 含核黄素的标准品或样品一旦加入亚硫酸盐后会因产生二氢化物失去荧光，但二氢化物在空气中又易重新氧化，恢复荧光，因此应在10min内检测完毕，而且越快越好。
  
• 如果样品浓度过高，应用蒸馏水稀释后重测，结果乘以稀释倍数。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
  
• 本试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

• 稀释组织匀浆液：取适量的10×组织匀浆液，按10×组织匀浆液∶蒸馏水=1∶9的比例稀释，获得1×组织匀浆液，待用。
  
• 样品准备：
  
  • 固体样本：准确称量2～10g样品置于研磨器内研磨，加入少量1×组织匀浆液，研磨碎，留取上清，再次用1×组织匀浆液研磨，最后一并倒入50mL锥形瓶，加入1×组织匀浆液至40mL，充分摇匀，置于高压灭菌锅内，121℃下保持30min，冷却至室温后用稀氢氧化钠调pH值至6.0~6.5，用1×组织匀浆液定容至50mL；如样品杂质较多，可在氢氧化钠调至6.0后立即用稀盐酸再调pH值至4.5，4000g离心5min或者过滤，上清液或滤液再调pH值至6.0~6.5，定容，滤液4℃保存备用。
    
  • 液体样品：牛奶、饮料等液体样品，取5mL牛奶于50mL锥形瓶中，加入1×组织匀浆液至40mL，以下操作同上。
• 稀释标准品：取适量的Vitamin B2标准(100μg/mL)，按Vitamin B2标准(100μg/mL)∶蒸馏水=1∶9稀释成Vitamin B2标准(10μg/mL)，4℃保存。
  
  • Vitamin B2标准(100μg/mL)需要充分溶解混匀，否则会导致标准值不准确。
• 制备亚硫酸盐工作液：取一支亚硫酸盐100mg粉末，充分溶解于2mL蒸馏水，即配制成50mg/mL的亚硫酸盐工作液，即配即用，冰水浴保存，4小时内有效，也可以用精密天平自行称量溶解。
  
• Vitamin B2检测：选用恰当的滤色片，核黄素测定的激发波长为460nm，发射波长为520nm，提前预热仪器30min，蒸馏水调零，以下表6号管作参比溶液调荧光分光光度计的荧光强度读数到满刻度(100%)，分别测定其他标准溶液和样品溶液的相对荧光强度，在测定中如果样品溶液的荧光强度大于100%，需要稀释后再行测定。
  测定加入亚硫酸盐工作液前后的荧光值，分别记为F₀和F_T。加入亚硫酸盐后，应立即混匀，并在20s内测出各管荧光值。
  Vitamin B2检测标准曲线绘制及待测样品操作表
  

  加入物(mL)	1	2	3	4	5	6	样品
  Vitamin B2标准(10μg/mL)	0.125	0.25	0.5	0.75	1.0	1.25	—
  蒸馏水	4.875	4.75	4.5	4.25	4.0	3.75	—
  待测上清或滤液(mL)	—	—	—	—	—	—	5.0
  浓度(μg/mL)	0.25	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	—
  含量(μg)	1.25	2.5	5	7.5	10	12.5	—
  还原前荧光值F0
  亚硫酸盐工作液	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11	0.11
  还原后荧光值FT

溶液的荧光强度校准值：F＝F₀－F_T
F＝校正后的荧光强度
F₀＝还原前荧光强度
F_T＝还原后荧光强度
以各管Vitamin B2标准的浓度(μg/ml)或含量(μg)为横坐标，以对应的校正后的荧光强度(F)为纵坐标，做出Vitamin B2标准曲线。
根据Vitamin B2标准曲线及样品管的校正后的荧光强度(F)即可计算出待测样品中Vitamin B2的实际浓度和含量。
100mL液体样品中Vitamin B2含量(μg/100mL)= C×V₂×100/V₁
100g固体样品中Vitamin B2含量(μg/100g)=C×V₃×100/m
C＝待测样品中Vitamin B2的浓度(μg/mL)
V₁＝检测体系中加入的滤液体积(mL)＝5
V₂＝液体样本滤液的总体积(ml)＝50
V₃＝固体样品的上清液总体积(mL)＝50
m＝固体样品的质量(g)
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